為了減少由于海洋環(huán)境對生態(tài)的影響和對業(yè)已緊張的野生捕撈漁業(yè)的過度開發(fā)，并滿足日益擴大的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)對蛋白質(zhì)的日益增長的需求，研究人員和產(chǎn)業(yè)界一直在穩(wěn)步地從植物和動物飼料中尋找和評估各種魚粉替代蛋白質(zhì)來源。特別是，從循環(huán)經(jīng)濟的角度來看，黑水虻(BSF)幼蟲為開發(fā)可再生、可持續(xù)的替代蛋白質(zhì)來源提供了一種新的策略。這種方法也將為開發(fā)可持續(xù)的蛋白質(zhì)來源鋪平道路，同時減少與溫室氣體排放相關(guān)的傳統(tǒng)廢物處理，如填埋和焚燒。

近年來，黑水虻幼蟲因其良好的營養(yǎng)成分，如蛋白質(zhì)、脂類、不同功能分子(包括甲殼素、月桂酸、生物活性肽)和不同多糖，已成為潛在的替代蛋白質(zhì)成分之一。此外，它可以將有機廢物或副產(chǎn)品轉(zhuǎn)化為對土地和水的需求較低的昆蟲生物量。因此，它成為促進水產(chǎn)養(yǎng)殖循環(huán)經(jīng)濟的合適候選。另一方面，盡管植物蛋白在商業(yè)水產(chǎn)飼料配方中通常被用作魚粉的替代品。然而，必需氨基酸的缺乏和抗營養(yǎng)因子(ANFs)的存在使它們無法單獨添加到飼料中，因為這往往會導致水生動物消化不良和生長受損。盡管已有研究通過應(yīng)用發(fā)酵或補充限制礦物質(zhì)等方式來最小化這些缺陷，然而植物蛋白完全替代魚粉在馬龍螯蝦(Cherax cainii)等動物腸道健康的作用機制還有待探索。

近年來，高通量測序技術(shù)和計算分析技術(shù)的發(fā)展使得環(huán)境DNA (eDNA)樣品中微生物群落的檢測成為可能。此外，進一步開發(fā)eDNA數(shù)據(jù)庫和宏基因組預測工具，可以深入分析改變的環(huán)境條件和攝食制度下的微生物組成。本研究采用16S rRNA基因測序方法，對不同蛋白質(zhì)飼料條件下養(yǎng)殖的馬龍螯蝦腸道及養(yǎng)殖水體微生物多樣性和組成進行分析。

馬龍螯蝦采購自西澳大利亞Blue Ridge Marron Farm，實驗在Curtin水生研究實驗室(CARL)完成。170只馬龍螯蝦隨機分配到18個水箱(每個水箱9只，每組3個重復)，在開始喂養(yǎng)試驗前馴化7天。試驗期間沒有進行換水。用過濾網(wǎng)每周清理一次未食用的飼料和糞便。

配制了6種等蛋白質(zhì)、等脂、等熱量的飼料，包括魚粉（FM）、黑水虻飼料（BSF）、LPN、PBP、SOY和THS飼料(表1)。原料和飼料配方均由Glenn Forrest公司提供。根據(jù)AOAC (AOAC, 2005)的方法確定了飼糧的近似成分。每天下午以1.5%的總生物量進行飼喂。在第58、59和60天使用無菌塑料瓶收集200 ml/罐水樣，提取水環(huán)境中DNA。試驗結(jié)束時，從18個魚箱中共收集54條marron(3條/槽)進行腸道微生物測序分析。

1，水環(huán)境中微生物群落更加多樣化

測序結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，腸道和水樣共產(chǎn)生5731個OTUs(745個共有)，26個門(21個共有)和420個屬(229個共有)。其中，腸道54份樣品共獲得745個OTUs，系統(tǒng)發(fā)育劃分為21門229屬。水樣獲得5731個OTUs，分為26門420屬。氣單胞菌是腸道和水中最豐富的細菌。

2，腸道和水中的微生物群落截然不同

相對于腸道，水中alpha多樣性的豐富度、Simpson和Shannon測量值顯著更高(圖1 c)。此外，在水樣中發(fā)現(xiàn)獨特的OTUs和屬(191)的數(shù)量高于腸道。PCA分析對細菌OTUs進行聚類，發(fā)現(xiàn)腸道和水中具有顯著不同的微生物組成結(jié)構(gòu)(圖1E)。

3，氣單胞菌在腸道和水中普遍存在

不動桿菌屬、氣單胞菌屬、黃桿菌屬和假單胞菌屬在至少一個處理組的腸道和水樣中都有很高豐度。水中發(fā)現(xiàn)420個屬，其中191個屬與腸道共有，229個屬與腸道共有，表明以蛋白質(zhì)飼料喂養(yǎng)水生動物影響了水中復雜的細菌相互作用。氣單胞菌在腸道和水中均為優(yōu)勢菌。然而，只有SOYG(73%)和SOYW(67%)以及BSFG(37%)和BSFW(18%)在兩種不同環(huán)境中相對豐度具有相似性(圖2A)。除了氣單胞菌外，馬龍螯蝦的腸道微生物群落中還存在著較高豐度的弧菌(20.1%)、hafia-obesumbacterium(18.5%)、Candidatus Bacilloplasma(11.2%)和希瓦氏菌屬(8.3%)(圖2A)。在所有飼糧組中豐度較高的屬中，只有Candidatus Hepatoplasma和弧菌在腸道中的豐度顯著高于其他屬(圖2B)。其他差異細菌有擬桿菌屬、產(chǎn)酸擬桿菌屬、納米囊蟲屬、Cloacibacterium、Propionispira、fusbacter、Devosia和Hirschia(圖2B)。

4，蛋白質(zhì)飲食調(diào)節(jié)腸道和水中微生物群落

alpha多樣性測量結(jié)果顯示，LPNG的物種多樣性高于FMG。此外，與FMG和THSG相比，LPNG組的Shannon和Simpson均勻度有改善。與FMG相比，PBPG和SOYG的Shannon多樣性均勻度也更高(圖3A)。在745個OTUs中，只有21個(2.8%)被所有飲食組共享。FMG、BSFG、LPNG和THSG組產(chǎn)生的大多數(shù)OTU被發(fā)現(xiàn)在這些組內(nèi)和組間共享。PBPG(116)飼料產(chǎn)生的未共享OTUs最高，而THSG組僅獲得3個唯一OTUs(圖3B)。然而，PBPG組中大多數(shù)未共享的OTUs屬于相同的分類分支，主要屬于弧菌和C. Bacilloplasma。采用非度量多維尺度(NMDS)對不同蛋白質(zhì)飼糧中腸道樣本的細菌OTUs聚類結(jié)果如圖3C所示。動物飼料在腸道中產(chǎn)生的未共享OTUs最高(圖3E)。各飼糧組腸道細菌的相對豐度均顯示變形桿菌為優(yōu)勢菌群(72.8%)。只有PBP和BSF飼料組的Tenericutes豐度較高，分別占讀取豐度的42.8%和32.4%。然而，Proteobacteria和Tenericutes在所有組的分類reads中占98%。

在水中，alpha多樣性測量發(fā)現(xiàn)6個不同類群之間的豐富度、Simpson和Shannon指數(shù)沒有差異 (圖3G)。產(chǎn)生的OTU數(shù)量(16 498)在6個處理組中也沒有太大差異，從984 (FMW)到1190 (BSFW)不等?？傮w而言，6個水樣組只有5.2%(853)的OTUs被共享，其中THSW、PBPW、LPNW和BSFW組分別有3.1%(516)、2.6%(435)、1.9%(314)和1.8%(305)的OTUs被發(fā)現(xiàn)是唯一的(圖3H)。Bray-Curtis相對豐度差異的PERMANOVA值(R = 0.522, P = 0.032)表明，蛋白質(zhì)飼料對養(yǎng)殖馬龍螯蝦水體中微生物群落的遷移起著重要作用(圖3I)。盡管動物、昆蟲和植物來源在水中的豐富度和多樣性不顯著，但根據(jù)蛋白質(zhì)飼料來源，PCA分析顯示了了顯著的樣品分離性(R = 0.842, P = 0.001)(圖3J-L)，且黑水虻組的OTUs與其他組有顯著差異(P < 0.001)。與腸道樣品一樣，水中細菌大部分屬于變形菌綱(59.8%)。在所有類群中，第二大優(yōu)勢門是擬桿菌門(23.2%)和厚壁菌門(16.4%)，然而，在BSFW中，厚壁菌門豐度達到36.6%。與腸道相似，在屬水平上，水樣中所有類群的氣單胞菌均具有優(yōu)勢(36.6%)。

對于差異豐度菌的鑒定發(fā)現(xiàn)，SOYG飼糧有利于氣單胞菌和梭狀芽胞桿菌的生長，而LPNG飼糧有利于Vogesella、Flavobacterium和Pseudomonas的生長。相比之下，F(xiàn)MG、BSFG和THSG組分別增加了弧菌、希瓦氏菌和肥胖哈夫尼亞菌的豐度。在水中，LPNW有利于Desulfovibrio、Prevotella和鏈球菌的生長，BSF增強了Clostridium、Aquitalea和Lactobacillus, SOYW富集了氣單胞菌和乳球菌，PBPW提高了Cloacibacterium和Fimbriiglobus的豐度，THSW提高了Acidovorax和Stella的豐度。

5，預測元基因組的功能特征

Picrust2預測結(jié)果表明，動物和昆蟲蛋白FM、PBP、THS和BSF與氨基酸、脂肪酸、糖、蛋白質(zhì)和次生代謝產(chǎn)物的代謝和生物合成有關(guān)。此外，全脂BSF幼蟲飼料上調(diào)了馬龍螯蝦腸道中甲殼素的降解途徑。植物蛋白大豆激活類黃酮的生物合成和一些與細菌復制和發(fā)病有關(guān)的途徑，而LPN主要參與氨基酸的降解(圖4)。

6，微生物量化

PBP和BSF飼料中馬龍螯蝦腸道細菌數(shù)量顯著高于大豆、LPN和THS，與魚粉相比差異不顯著。與16S Illumina的數(shù)據(jù)相似，THS飼料喂養(yǎng)的馬龍螯蝦細胞數(shù)最低。在水中，BSF飼料的細胞數(shù)最高，顯著高于其他試驗飼料。除BSF外，PBP和FM的細菌細胞計數(shù)相對于THS也較高(表2)。e值(有效率)為89.6,R2為0.998，表明所有樣品qPCR數(shù)據(jù)的可靠性和可重復性。 

家禽副產(chǎn)品（PBP）和黑水虻（BSF）蛋白質(zhì)源的飼料提高了腸道和水中細菌的多樣性，其中包括一些有益菌，表明PBP和BSF蛋白質(zhì)源飼料可能有利于馬龍螯蝦養(yǎng)殖。建議進一步研究PBP和BSF中可能影響飲食和水中微生物群落的潛在成分，并進一步研究飼料和糞便物質(zhì)在決定馬龍鰲蝦養(yǎng)殖過程中細菌動態(tài)的作用。