使用傳統(tǒng)方法從BSFL生物質中提取脂肪以生產生物柴油需要大量溶劑，較長提取時間和熱條件。

     本研究提出了一種酶輔助提取方法，用于從BSFL生物質中提取脂肪以生產生物柴油。在用正己烷提取之前，將不同的蛋白酶用于預處理BSFL生物質。在測試的酶中，復合蛋白酶對預處理最為有效，從而導致最高的脂肪產量（與未經酶處理的提取相比，脂肪產量增加了2.2倍）。

     獲得的優(yōu)化的條件是水與生物質的重量比為4.33：1，酶的量為3.85％，酶促的處理溫度為38.1℃，酶處理時間為4.27h，最大脂肪產率為36.09％。

1、實驗材料：

      BSFL由臺灣苗栗縣畜牧研究所提供；使用的五種商業(yè)蛋白酶分別是Flavourzyme（風味蛋白酶），Protamex（復合蛋白酶），Chamzyme FP（糜蛋白酶），Bromelain（菠蘿莖蛋白酶）和Papain（木瓜蛋白酶），購自Challenge BioproductsCo。，Ltd。（臺灣云林市） 包括正己烷（95％）和甲醇（99.5％）的試劑購自Tedia Company，Inc.（美國費爾菲爾德）。

2、實驗方法：

2.1、酶處理對脂肪提取的影響

     進行了有無蛋白酶處理的BSFL生物質中脂肪的溶劑萃取，使用攪拌器將新鮮的BSFL勻漿，然后用不同的蛋白酶處理。在30℃下通過攪拌將10g均質化的BSFL與0.2g蛋白酶和25mL水溫育60分鐘來進行酶處理。然后將混合物離心，并除去水相。隨后在攪拌下將所得生物質在室溫下浸入正己烷（1：5，w / v）中60分鐘。通過過濾獲得含有脂肪的己烷層。然后通過使用旋轉蒸發(fā)儀除去正己烷來收集脂肪，用無水硫酸鈉處理，然后在105℃下干燥過夜至恒重，計算脂肪含量。

2.2、酶輔助溶劑提取的優(yōu)化

     使用四因子，三級BoxeBehnken設計研究了酶處理因子對提取效率的影響。在100 mL錐形瓶中使用不同的水與生物質重量比（1：1-7：1），酶（1％-7％），處理溫度（30-50 ℃）和處理時間（1-7 h）進行酶處理。攪拌。酶處理過程完成后，隨后將所得生物質在室溫下浸入正己烷（1：5，w / v）中60分鐘。然后獲得BSFL脂肪，并確定脂肪產量。使用以下等式對確定的脂肪產量與酶處理因子的關系進行RMS建模如下：

      其中Y，X1，X2，X3和X4分別是脂肪產量（％），水與生物量的重量比，酶負載（％），處理溫度（C）和處理時間（h）。a0是截距系數；a1-a4是線性系數；a12，a13，a14，a23，a24和a34是相互作用系數；a11，a22，a33和a44是平方系數。使用Minitab 16進行回歸分析和方差分析（ANOVA）。然后將開發(fā)的模型用于研究因變量的相互影響，并通過求解回歸方程來獲得最佳條件。

2.3、酶的可重用性

      測試了蛋白酶的可重復使用性以進行酶處理。酶處理過程在優(yōu)化條件下進行。酶處理過程完成后，將混合物以5000 rpm離心10分鐘以實現固/液相分離。將得到的生物質（固相）在室溫下浸入正己烷（1：5，w / v）中60分鐘以提取BSFL脂肪，然后確定脂肪產量。收集含有蛋白酶的水相，并將其用于新的酶處理過程。

2.4、由提取的脂肪合成生物柴油

      在反應器中將脂肪與甲醇（摩爾比為8：1）和催化劑H2SO4（1％，w / w）混合，并且在攪拌下在75℃下進行酯化反應60分鐘。酸催化的酯化反應完成后，將反應混合物轉移至分液漏斗中進行相分離。然后將含有生物柴油和BSFL脂肪的上層相引入一個新容器中，以進行堿催化的酯交換反應。酯交換過程是在以下條件下進行的：甲醇與脂肪的摩爾比為6：1；催化劑0.8％NaOH（w / w）和65℃。30分鐘后，通過重力分離反應混合物，隨后收集含有生物柴油的上層相并在80℃下蒸餾以除去殘留的甲醇。然后將所得生物柴油用于生物柴油組成和生物柴油性能測定。

3.1、酶篩選

     如圖1所示，未經酶處理的BSFL提取導致脂肪產量低（8.10％）

     與未經酶處理的提取過程相比，提取前用蛋白酶處理生物質能獲得更高的脂肪產量。

     在這些生物催化劑中，復合蛋白酶表現出最高的水解活性，提供最高的脂肪產率（18.17％）

菠蘿蛋白酶表現出最低的水解活性。

3.2、處理因素對脂肪提取的相互影響

     圖2顯示了當將處理溫度和處理時間保持在恒定值時，水與生物質重量比和蛋白酶負載量對脂肪產量的綜合影響。在特定的酶含量下，脂肪產量隨水與生物量的重量比增加。然而，當脂肪產量達到最大水平時，較高的水與生物質重量比導致脂肪產量下降。這可能是因為大量的水降低了酶的活性和穩(wěn)定性，減少了蛋白酶引起的組織和細胞膜的降解，從而減少了提取效率。

     圖3說明了蛋白酶負荷和溫度對脂肪產量的綜合影響，其余因素保持在恒定水平。在任何處理溫度下，脂肪產量均隨酶負荷的增加而增加。這歸因于酶對組織和細胞膜成分降解的積極作用。然而，較高的酶負載水平導致上述趨勢的逆轉。這可能是因為過量的酶會導致酶聚集，從而限制酶的靈活性并導致酶與底物結合位置的空間位阻，從而降低酶的降解效率。在本研究中，復合蛋白酶的最高活性顯示在38.1℃。

     圖4顯示了處理溫度和時間對脂肪產量的綜合影響，在指定的溫度下，脂肪的含量隨處理時間的增加而顯著增加。當獲得最大脂肪產量時，進一步增加處理時間會導致脂肪產量減少。這種現象可能是因為較長的處理時間可能會增加細胞成分的釋放，引起蛋白質脂質聚集體的形成和乳液的穩(wěn)定化，從而降低了脂肪的提取效率。

3.3、獲得最佳的酶輔助提取條件

      通過求解RSM模型[等式（3）]，計算出獲得最大響應的最佳條件為：水與樣品的重量比為4.33：1，蛋白酶負載為3.85％，處理溫度為38.1℃，且處理時間為4.27h，相應的Y=35.28％。為了驗證優(yōu)化結果，在優(yōu)化條件下進行了實驗，實際脂肪產率為36.09％±0.11％。此外，這項研究的脂肪產量高于我們之前的研究（30.2％），其中僅使用正己烷提取BSFL脂肪48小時，差異可能是因為用蛋白酶預處理通過降解組織和細胞膜改善了脂質的釋放。

3.4、蛋白酶的可重復使用性

     在本研究中，酶處理過程是在最佳條件下進行的，以研究復合蛋白酶的可重復使用性。如圖5所示，復合蛋白酶可以有效地重復使用多達5次以水解BSFL生物質。因此，使用正己烷可有效提取經處理的BSFL生物質，而不會顯著降低脂肪產量。該結果表明，復合蛋白酶是酶輔助提取過程中很有希望的蛋白酶，可以重復使用以提高經濟可行性。

3.5、BSFL脂肪的特征

     表4列出了提取的BSFL脂肪的特性。提取的脂肪的碘值為90.1g I/100g，這表明提取的脂肪比植物油更飽和。提取的脂肪的酸值為13.4 mg KOH/g，表明脂肪中存在高含量的游離脂肪酸。提取的脂肪的皂化值為227.3mg KOH/g，表明BSFL脂肪的平均摩爾質量為786.8g/mol。因此，這表明酶處理對BSFL脂肪的特性沒有顯著影響，并且提取的脂肪已被確定為生物柴油合成的合適原料.

3.6、脂肪酸組成

     如表5所示，合成的BSFL生物柴油包含九種脂肪酸，其中月桂酸（31.15％），油酸（27.80％）和棕櫚酸（22.63％）是主要酸。合成的BSFL生物柴油包含65.99％的飽和脂肪酸，其組成與以前的BSFL生物柴油相似，其組成是僅使用溶劑未經酶處理（66.5％）從溶劑中提取的脂肪合成的。這表明酶處理過程對BSFL脂肪的脂肪酸組成沒有影響。合成的BSFL生物柴油中飽和脂肪酸的含量為65.99％，高于菜籽生物柴油中的飽和脂肪酸的4.3％。結果表明，提取的BSFL脂肪是生物柴油合成的合適原料。

3.7、燃油特性

    合成生物柴油的大多數特性，例如粘度（5.3 mm2/s），酸值（<0.5 mg KOH/g），水含量（300 mg/kg），密度（875 kg/m3），酯含量（98.7％），十六烷指數（50）和閃點（121 ℃）都符合ASTM D6751和EN 14214，表明BSFL生物柴油可以代替石油柴油。

     在BSFL生物柴油的特性中，硫含量強烈取決于反應的類型。合成的BSFL生物柴油中存在硫（0.04％）是因為硫酸被用作生物柴油合成的催化劑。通過使用酶催化的方法生產生物柴油可以消除這一缺陷。在這項研究中，BSFL生物柴油的十六烷指數和粘度優(yōu)于菜籽生物柴油。這些發(fā)現表明，合成的生物柴油具有吸引人的特性，并且可以替代石油柴油。

3.8、技術和經濟評估

     圖6給出了從BSFL提取脂肪的酶輔助工藝和常規(guī)（非酶處理）工藝的建議工藝流程圖

     圖6A將干燥的BSFL生物質與己烷在混合罐（M-02）中以1：4的比例混合。隨后在均質器（H-01）中研磨BSFL生物質，并在固/液（S / L）分離器（S-02）中將細胞碎片與含有BSFL脂肪的己烷相分離。然后通過在蒸發(fā)器V-01中除去己烷來獲得BSFL脂肪。

     圖6B的酶輔助提取方法需要一個額外的混合罐（用于酶處理）和一個S / L分離器（用于分離BSFL生物質和含水酶），但是該方法避免了在脂肪提取步驟中使用均質機（H-01）。

     在測試的蛋白酶中，復合蛋白酶被確定為提取BSFL脂肪的最有效降解酶。

     使用RSM對復合蛋白酶輔助的溶劑萃取進行了優(yōu)化，最大脂肪產率達到了36.09％，并得到了驗證。 

     隨后將提取的BSFL脂肪用于生產生物柴油，合成的生物柴油的大多數特性與ASTM規(guī)范D6751和歐洲標準EN 14214一致。

     擬議的提取工藝還證明了工業(yè)應用的經濟可行性。這些結果表明，酶輔助溶劑萃取可能是從BSFL提取脂肪的有效方法，并且合成的BSFL生物柴油可以替代石油柴油。