常見問題

黑水虻幼蟲脂肪脂肪酸富集組分可抑制水產(chǎn)抗多藥耐藥致病菌氣單胞菌

發(fā)布日期：2021-09-30 11:22:40瀏覽次數(shù)：694

前言

氣單胞菌屬作為一種條件致病菌，引起的細(xì)菌侵染不僅影響了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)基礎(chǔ)，還可通過水產(chǎn)品和水生動(dòng)物感染人畜，輕者導(dǎo)致人畜腹瀉，重者食物中毒甚至是敗血癥，嚴(yán)重影響人類以及牲畜健康。細(xì)菌性魚類疾病通常用抗生素治療，而抗生素的長期使用會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌耐藥。耐藥菌的發(fā)展和傳播與環(huán)境中的抗菌素殘留相結(jié)合，而人類可以通過環(huán)境接觸或食物鏈接觸耐藥菌，這就成為了公共健康問題。

黑水虻（Hermetia illucens）幼蟲在水產(chǎn)飼料生產(chǎn)中具有很好的經(jīng)濟(jì)前景。從營養(yǎng)的角度來說，黑水虻含有大量的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)（分別為 307.5–588.0 g/Kg 和 113.0–386.0 g/Kg）。在脂肪酸譜方面，黑水虻通常富含飽和脂肪酸 (SFA)，而缺乏多元不飽和脂肪酸 (PUFA)。最近的幾項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，幼蟲血淋巴和蛆提取物以及分泌物的抗菌活性有望用于開發(fā)新的具有治療價(jià)值的抗菌劑，特別是在防御多重耐藥“超級細(xì)菌”方面。據(jù)報(bào)道，來自黑水虻脂肪的不飽和油酸 (18:1, n-9) 和亞油酸 (18:2, n-6) 具有很高的營養(yǎng)價(jià)值。此外，黑水虻脂肪富含中鏈月桂酸，其對破壞細(xì)菌細(xì)胞膜具有抗菌活性。黑水虻幼蟲脂肪的酸性水-甲醇提取物 (AWME) 對當(dāng)代植物病原體也具有抗菌潛力。

本研究旨在比較對黑水虻脂肪連續(xù)萃取物的組成和抗菌特性。在魚類病原體中，嗜水氣單胞菌和殺鮭氣單胞菌對不同標(biāo)準(zhǔn)抗生素均表現(xiàn)出多重耐藥性 (MDR)。本研究首次證明了連續(xù)萃取物對氣單胞菌菌的高劑量依賴性抗菌活性，尤其是多重耐藥性殺鮭氣單胞菌。通過連續(xù)萃取，萃取物的抑菌和殺菌 (MIC/MBC) 活性顯著增強(qiáng)。第三次連續(xù)萃取物 (AWME3) 對氣單胞菌屬具有最高抗菌活性。因此，黑水虻的幼蟲脂肪可以作為一種極好的生物活性分子庫，其具有良好的根除多重耐藥細(xì)菌的能力，在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域具有實(shí)際應(yīng)用潛力。

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方法

實(shí)驗(yàn)使用脂肪分離自機(jī)械壓榨機(jī)壓緊的 15 天齡的活的黑水虻幼蟲。使用酸性水-甲醇溶液對黑水虻脂肪進(jìn)行連續(xù)萃取。即，將壓縮的黑水虻幼蟲在提取溶液中熱處理后進(jìn)行劇烈的漩渦。在室溫下連續(xù)提取 24 小時(shí)后，將混合物超聲處理后劇烈均質(zhì)，最后離心以分離不溶性脂肪。以上步驟連續(xù)進(jìn)行三輪。最后，所有提取物真空濃縮后儲(chǔ)存直至使用。

在 Muller-Hinton 瓊脂中使用圓片擴(kuò)散試驗(yàn)測定了嗜水氣單胞菌和殺鮭氣單胞菌的抗生素敏感性，計(jì)算了每個(gè)菌株的多重耐藥性（MDR）指數(shù)。在 Mueller-Hinton 瓊脂平板上，通過測量抑菌圈的直徑測定每個(gè)連續(xù)萃取物（AWME1、AWME2 和 AWME3）的抗菌活性。通過微量稀釋測定方法確定最小抑制濃度 (MIC)?；贏WME3 和抗菌劑 (DOX)分別處理后不同時(shí)間點(diǎn)測定半抑制濃度（MIC50），通過比濁測定法測定并繪制測試菌株的生長曲線。

使用氣相色譜儀分析對黑水虻脂肪的連續(xù)萃取物。通過與美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院 (NIST) 庫中存儲(chǔ)的真實(shí)化合物的光譜數(shù)據(jù)庫進(jìn)行保留時(shí)間 (min)、峰面積、峰高和質(zhì)譜圖的比較，確定了色譜峰與NIST-8 庫相似指數(shù) (SI) ≥70% 匹配的化合物。

對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用重復(fù)測量的雙向方差分析（Two‐way RM‐ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以確定處理之間的顯著統(tǒng)計(jì)差異。

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結(jié)果

圖2 由圓盤擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)確定的嗜水氣單胞菌和殺鮭氣單胞菌對三次連續(xù)提取物的敏感性。

(a) AWME1 (Ex#1) 和 AWME2 (Ex.#2) (b) AWME3 (Ex.#3) 和三次萃取混合物（MIX）；(c) 陽性對照和陰性對照。

圖3 嗜水氣單胞菌和殺鮭氣單胞菌對三次連續(xù)提取物的敏感性。

數(shù)據(jù)表明，順序提取程序逐漸增強(qiáng)了萃取物對致病性魚類細(xì)菌的抗菌活性。

圖4 通過圓盤擴(kuò)散試驗(yàn)驗(yàn)確定的嗜水氣單胞菌和殺鮭氣單胞菌對第三次萃取物（AWME3）的劑量依賴敏感性。

(a,b) 在孵育 12 小時(shí)和 24 小時(shí)后的不同劑量AWME3 組的IZD；(c) 在孵育 12 小時(shí)和 24 小時(shí)后的陽性對照和陰性對照的IZD。

圖5 和殺鮭氣單胞菌對第三次萃取物（AWME3）的劑量依賴敏感性。

在孵育 12 小時(shí)和 24 小時(shí)后，嗜水氣單胞菌和殺鮭氣單胞菌均受到第三次萃取物（AWME3）抑制。并且，從它們的抑菌圈大小中觀察到了嗜水氣單胞菌和殺鮭氣單胞菌對第三次萃取物（AWME3）的劑量依賴敏感性。值得注意的是，殺鮭氣單胞菌比嗜水氣單胞菌對第三次萃取物（AWME3）更敏感。

圖6 分別用強(qiáng)力霉素（DOX）第三次萃取物（AWME3）處理的魚類病原菌的半抑制濃度MIC50。用 (a) 多西環(huán)素 (DOX) 和 (b) 第三次萃取物（AWME3）處理的嗜水氣單胞菌；用（c）強(qiáng)力霉素（DOX）和（d）第三次萃取物（AWME3）處理的殺鮭氣單胞菌。

半抑制濃度 (MIC50)表示測試群體中≥50% 的菌株被抑制時(shí)的 MIC 值。MIC50值的比較表明，殺鮭氣單胞菌株對 DOX 的耐藥性始終高于嗜水氣單胞菌株。相比之下，在任意時(shí)間點(diǎn)，兩種菌株對第三次萃取物（AWME3）的敏感性差異較?。∕IC50 值僅相差 2-3 倍）。

圖7 顯示了第三次萃取物（AWME3）和強(qiáng)力霉素（DOX）對嗜水氣單胞菌和殺鮭氣單胞菌培養(yǎng)24 小時(shí)內(nèi)菌群內(nèi)活細(xì)胞數(shù)量的影響。

在第三次萃取物（AWME3）濃度≤24 μg/mL 的情況下，嗜水氣單胞菌生長的滯后期延長至 4 小時(shí)，而在 DOX 濃度≤0.125 μg/mL 的情況下，僅延長兩小時(shí)。用濃度≤190 μg/mL 的第三次萃取物（AWME3）和濃度≤0.78 μg/mL 的DOX 處理殺鮭氣單胞菌的滯后期為2 小時(shí)。在第三次萃取物（AWME3）濃度≥190 μg/mL 和 DOX 濃度≥0.250 μg/mL 的處理下，嗜水氣單胞菌沒有出現(xiàn)對數(shù)生長期，而對于殺鮭氣單胞菌在第三次萃取物（AWME3）和 DOX 處理下不生長的濃度分別為≥380 μg/mL 和≥6.25 μg/mL。

這些結(jié)果表明，提取自黑水虻幼蟲脂肪的第三次萃取物（AWME3）早在孵育 6 小時(shí)就可以預(yù)防和持續(xù)抑制魚類病原體的增殖和生長，包括耐抗生素的殺鮭氣單胞菌，因此有可能用作抗菌劑。

圖7 用不同濃度的第三次萃取物（AWME3）或 DOX 處理的菌株生長曲線。

(a,b) 嗜水氣單胞菌 (c,d) 殺鮭氣單胞菌

黑水虻幼蟲脂肪連續(xù)萃取后主要成分是游離脂肪酸（FFA）和其衍生物。在 FFA 中，與不飽和脂肪酸 (USFA) 相比，飽和脂肪酸 (SFA) 的含量占濃度的兩倍。AWME1、AWME2和AWME3中SFAs的含量分別為59.2%、51.09%和51.32%，而USFAs的含量分別26.05%、27.42%和29.64%。主要的FFAs是n‐十六烷酸(棕櫚酸)，八烷酸‐9‐酸(油酸)，十二烷酸(月桂酸)，十四烷酸(肉豆蔻酸)和十八烷酸(硬脂酸)。與其他階段的萃取物相比，AWME3 作為抑制致病性魚類細(xì)菌的最有效抗菌劑富含順式油酸 (C18:1, 26.28%)和甘油。GC-MS 結(jié)果表明，在從黑水虻幼蟲脂肪中提取的其他階段萃取物成分中，AWME3 具有最多的 USFA、順式雙鍵化合物和甘油，這表明它抗菌效果最佳。

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結(jié)論

本研究通過改進(jìn)提取工藝，使用酸性水-甲醇溶液對黑水虻幼蟲脂肪進(jìn)行連續(xù)三次萃取?？咕幬锩舾行栽囼?yàn)表明，每一種萃取物對重要的魚類致病性細(xì)菌嗜水氣單胞菌和殺鮭氣單胞菌，特別是耐藥殺鮭氣單胞菌的抗菌活性都具有高劑量依賴性。此外，通過改進(jìn)的萃取程序，可以逐漸豐富不飽和脂肪酸(USFAs)在萃取物中的含量，因而其抗菌活性得以不斷提高。

由此可見，黑水虻幼蟲脂肪是良好的生物活性分子庫，具有殺滅細(xì)菌甚至耐藥菌的能力，因此在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域具有很好的實(shí)際應(yīng)用潛力，可作為抗生素的替代品。

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“鳳凰蟲” 蟲漿

純黑水虻幼蟲加工

富含脂肪酸、抗菌肽

增強(qiáng)水產(chǎn)免疫

廣州無兩生物科技有限公司產(chǎn)品

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感謝原文作者的研究與分享：

Mohamed, H.; Marusich,E.; Afanasev, Y.; Leonov, S. Fatty Acids-Enriched Fractions of Hermetia illucens (Black Soldier Fly) Larvae Fat Can Combat MDR Pathogenic Fish Bacteria Aeromonas spp. Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 8829. https://doi.org/10.3390/ijms22168829

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